Spiegare come la decomposizione fungina del legno morto

• Laboratorio di Microbiologia Ambientale, Istituto di Microbiologia dell'Accademia Ceca delle Scienze, Praga, Repubblica Ceca La

decomposizione del legno morto è responsabile di una quantità significativa di turnover di carbonio (C) nelle foreste naturali. Mentre il legno morto fresco contiene principalmente composti vegetali ed è estremamente povero di azoto (N), la biomassa fungina e il contenuto di N aumentano durante la decomposizione. Qui, abbiamo esaminato 18 ceppi batterici sequenziati con genoma che rappresentano i taxa dominanti del legno morto per valutare i loro adattamenti all'utilizzo di C e N nel legno morto. Diverso set di geni per l'efficiente decomposizione di biopolimeri di pareti cellulari vegetali e fungine sono stati trovati in Acidobacteria, Bacteroidetes e Actinobacteria . A differenza di questi gruppi, gli alfaproteobatteri e i gammaproteobatteri contenevano meno enzimi attivi nei carboidrati e dipendevano da fonti di C a bassa massa molecolare o dalla micofagia. Questo gruppo, tuttavia, ha mostrato ricchi complementi genici per la fissazione dell'N ₂ e la riduzione di nitrati/nitriti, passaggi chiave dell'assimilazione e del dissimilazione nel ciclo dell'N del legno morto. Mostriamo che i fissatori N ₂ possono ottenere C indipendentemente dai biopolimeri vegetali o dalla biomassa fungina. La successione dei batteri sul legno morto in decomposizione riflette la loro capacità di far fronte al cambiamento della qualità dei composti contenenti C e all'aumento del contenuto di N.

Introduzione

La decomposizione del legno morto nelle foreste è un processo complesso durante il quale I polimeri vegetali come la cellulosa, l'emicellulosa e la lignina sono sfruttati dai membri della comunità microbica. Poiché il microbioma del legno morto è dominato dai funghi, i loro costituenti della parete cellulare rappresentano un'altra importante risorsa, soprattutto nelle fasi tardive di decomposizione. Si stima che il legno morto contenga l'8% dello stock totale di carbonio (C) forestale globale (Pan et al., 2011; Martin et al., 2021), rendendolo un'importante fonte di carbonio. Tuttavia, il grado di recalcitranza del C nei componenti del legno morto varia considerevolmente e cambia nel tempo con l'avanzare della decomposizione. Funghi e batteri producono una vasta gamma di enzimi per accedere a fonti complesse di C, tipicamente chiamate enzimi attivi nei carboidrati (CAZymes, Berlemont e Martiny, 2015). La partizione della nicchia della fonte C nell'utilizzo dei composti C è osservata tra i taxa microbici (Gallardo et al., 2021), così come vari livelli di opportunismo nell'acquisizione di C (Lladó et al., 2019), in cui i prodotti di degradazione rilasciati possono essere utilizzati da microbi incapaci di decomporsi senza la necessità di investire nella produzione di enzimi (Berlemont e Martiny, 2013). A differenza del C, il contenuto iniziale di azoto (N) nel legno morto è estremamente basso (tipicamente <1%), il che porta a una forte limitazione dell'azoto della crescita microbica e della colonizzazione del substrato (Tláskal et al., 2017). L'azoto si accumula nel legno morto durante la decomposizione a causa del trasporto attraverso il micelio di funghi ectomicorrizici e di foraggiamento del suolo (Philpott et al., 2014) o attraverso l'attività della comunità batterica diazotrofica (Rinne et al., 2016; Tláskal et al., 2021a). Tale aumento allevia gradualmente la limitazione dell'azoto, portando ad un rapporto C/N più favorevole dell'intero habitat (Weedon et al., 2009).

Uno studio precedente che ha analizzato la decomposizione del legno morto di Fagus sylvatica attraverso l'analisi del metatrascrittoma ha dimostrato il ruolo principale di funghi in rilascio di C, come dimostrato dalla loro predominanza nella produzione di CAZyme (Tláskal et al., 2021a). In particolare, anche la composizione della comunità batterica nel legno morto è fortemente influenzata dai funghi a causa del loro accesso primario alle risorse di C (Odriozola et al., 2021). L'effetto dei funghi sui batteri potrebbe essere diretto (ad esempio attraverso l'antibiosi) o indiretto attraverso l'acidificazione del substrato, consentendo la selezione di taxa batterici tolleranti agli acidi (Valášková et al., 2009; Christofides et al., 2019; Johnston et al., 2019). La formazione di biomassa fungina rappresenta anche una base nutrizionale per diversi batteri (Brabcová et al., 2016; López-Mondéjar et al., 2018). Tali batteri micofagi hanno sviluppato enzimi per la degradazione della chitina per superare la limitazione dell'azoto nutrendosi di biomassa fungina contenente chitina ricca di N e chitosano (Uroz et al., 2013; Brabcová et al., 2016; Starke et al., 2020). Come risultato della modulazione fungina e delle mutevoli condizioni nel substrato, la composizione e l'abbondanza della comunità batterica nel legno morto cambiano nel tempo mostrando un aumento della biomassa batterica e della successione dei taxa verso una comunità simile a quella del suolo (Rinta-Kanto et al., 2016; Tláskal et al., 2017). Tra i fattori che influenzano la composizione della comunità batterica nel legno morto, i più spesso riportati sono il pH, il rapporto C:N e il contenuto di acqua (Folman et al., 2008; Hoppe et al., 2015; Tláskal et al., 2017; Moll et al., 2018; Mieszkin et al., 2021), ma anche la composizione del biopolimero e l'abbondanza fungina sono importanti (Rinta-Kanto et al., 2016; Odriozola et al., 2021). A causa della conoscenza limitata dei tratti funzionali dei batteri del legno morto, non è chiaro come esattamente questi fattori influenzino i membri della comunità batterica o viceversa e quali adattamenti rendano le specie batteriche di successo in vari fasi di decomposizione del legno morto.

Mentre i metodi indipendenti dalla coltura possono fornire il miglior quadro della composizione della comunità batterica e dell'espressione genica, la caratterizzazione di isolati di batteri dominanti rappresenta l'approccio migliore per la caratterizzazione dei loro fenotipi e tratti (Lladó et al., 2016). Il sequenziamento del genoma degli isolati batterici ha aiutato a distinguere le gilde funzionali di decompositori e opportunisti all'interno dei batteri del suolo (Lladó et al., 2019). Sebbene l'analisi del metagenoma possa aiutare a prevedere i tratti batterici in base alla costruzione di genomi assemblati con metagenoma (MAG, Tláskal et al., 2021a), questo approccio presenta molteplici limitazioni. I MAG sono per lo più incompleti, soggetti a potenziale contaminazione da parte di sequenze non bersaglio e spesso difficili da collegare alle sequenze geniche esistenti dell'rRNA 16S e, come tali, alle esatte identità batteriche (Bowers et al., 2017). Inoltre, la capacità di anche il recupero dei batteri dominanti come MAG è variabile (Nayfach et al., 2020). Tutte queste limitazioni possono essere superate mediante la caratterizzazione isolata, che offre anche l'opportunità di screening fenotipico nelle colture (Madin et al., 2020).

Il presente studio ha isolato i batteri dominanti dal legno morto in decomposizione per descriverne i tratti funzionali attraverso il sequenziamento del genoma e l'analisi del fenotipo e ha utilizzato queste informazioni per spiegare la preferenza di specifici taxa batterici per determinate fasi di decomposizione del legno morto. Ci siamo concentrati sulla capacità batterica di rilasciare C da polimeri vegetali e fungini e sulle vie di ciclo dell'N assimilatorio e dissimilatorio batterico. Ci aspettiamo che i batteri dominanti mostrino occorrenze diverse durante le fasi di decomposizione del legno morto, guidate dalla disponibilità del substrato e dalla loro capacità metabolica di essere limitate dall'identità tassonomica.

Materiali e metodi

Isolamento

da deformazione Questo studio è stato condotto nella Riserva Naturale Nazionale di Žofínský Prales, una foresta temperata non gestita nel sud della Repubblica Ceca (48°39′57"N, 14°42′24"E). La zona centrale della riserva forestale (42 ettari) non è mai stata gestita e qualsiasi intervento umano è cessato nel 1838 quando è stata dichiarata riserva. Questa riserva rappresenta quindi un raro frammento di foresta vergine temperata europea con legno morto lasciato a decomporsi spontaneamente. La riserva si trova a 730-830 m sul livello del mare e il substrato roccioso è quasi omogeneo ed è costituito da granito porfirico e biotite a grana fine e media. La piovosità media annua è di 866 mm e la temperatura media annuale è di 6,2°C (Anderson-Teixeira et al., 2015). Attualmente, la riserva è coperta da una foresta mista dove Predomina Fagus sylvatica in tutte le classi di diametro (51,5% del totale vivente). volume di legno), seguita da Picea abies (42,8%) e Abies alba (4,8%). Il volume medio dell'albero vivente è di 690 m ³ h ⁻¹ , e il volume dei detriti legnosi grossolani (tronchi, rappresentati dai tronchi d'albero e dai loro frammenti) varia da 102 a 310 m ³ h ⁻¹ con una media di 208 m ³ h ⁻¹ (Král et al., 2010; Šamonil et al., 2013). I tronchi vengono esaminati ripetutamente e si conosce l'età approssimativa di ciascun tronco, la causa della morte (rottura dello stelo, lancio del vento, ecc.) e lo stato prima dell'abbattimento (fresco, decomposto).

I campioni di legno in decomposizione sono stati raccolti come descritto in precedenza (Tláskal et al., 2017). In breve, i tronchi d'albero morti (detriti legnosi grossolani; CWD) di F. sylvatica, P. abies e A. alba con diametri di altezza del petto compresi tra 30 e 100 cm al momento dell'abbattimento sono stati scelti per rappresentare uniformemente tutti i lunghezze di decomposizione (classi di età) del legno morto e campata della gamma di diametri. Gli alberi che si decompongono come ostacoli permanenti sono stati omessi per escludere la CWD con lunghezze di decadimento poco chiare. La lunghezza del decadimento della CWD variava da <5 a >38 anni. Nell'ottobre 2013 sono stati prelevati quattro campioni mediante perforazione con trapano elettrico coprendo verticalmente alburno e durame lungo tutto il fusto in decomposizione. Parte del materiale è stato utilizzato per la descrizione delle comunità fungine e batteriche e della chimica del legno (Baldrian et al., 2016; Tláskal et al., 2017), mentre un'altra parte è stata utilizzata per l'isolamento dei batteri. Per quest'ultima categoria di sottocampioni, i trucioli di legno di ciascun stelo sono stati raggruppati insieme e trasportati in laboratorio, dove sono stati raffreddati fino al giorno successivo. Circa 2 g di materiale legnoso sono stati agitati con 15 mL di soluzione di Ringer per 2 ore e questa sospensione è stata diluita 10 ⁴ –10 ⁶ ×. Cinque centinaia di microlitri di ciascuna diluizione sono stati piastrati su terreno NB a contenuto nutritivo limitato (0,26 g L ⁻¹ brodo nutriente, 15 g L ⁻¹ agar, pH 5) e terreno WYA4 (0,1 g L ⁻¹ estratto di lievito, 15 g L ⁻¹ agar, pH 5, Valášková et al., 2009) con cicloesimide (50 mg L ⁻¹ ). La presenza di colonie batteriche è stata registrata su piastre di Petri incubate a 24°C per 8 settimane e contrassegnate con un marcatore che indica la settimana della prima comparsa. La PCR delle colonie è stata utilizzata per dedurre la tassonomia dei ceppi selezionati che sono apparsi durante il corso dell'incubazione. La premiscela PCR e le condizioni di ciclo erano le seguenti: 2,5 μl di tampone al 10× per DyNAzyme DNA polimerasi; 0,75 μL di DNA polimerasi DyNAzyme II (2 u μL ^-1 ); 0,75 μL di BSA (20 mg mL ^-1 ); 0,5 μL di PCR Miscela nucleotidica (10 mM); 1 μL di primer eub530f (10 μM, 5′-GTG CCA GCM GCN GCG G); 1 μL di primer eub1100br (10 μM, 5'-GGG TTN CGN TCG TTG, Lane, 1991) e ddH sterile ₂ O fino a 25 μL, con amplificazione iniziata a 94°C per 5 min seguita da 35 cicli di 94°C per 1 min, 62°C per 1 min, 72°C per 1 min e una presa finale di 72°C per 10 min. Il sequenziamento Sanger è stato eseguito dal primer inverso come servizio esterno. Le sequenze ottenute sono state confrontate mediante BLASTn con i dati della comunità batterica 16S basata sull'rRNA degli stessi oggetti di legno morto utilizzati per l'isolamento (Tláskal et al., 2017). Per ulteriori coltivazioni sono stati selezionati ceppi batterici con elevata somiglianza (>97%) e copertura (>90%) rispetto agli OTU di legno morto più abbondanti. I ceppi che sono stati coltivabili su terreni di laboratorio in I passaggi e quelli che mostravano una crescita e una produzione di biomassa sufficienti sono stati utilizzati per il sequenziamento del genoma e i test di coltura. Con questo approccio, siamo stati in grado di selezionare 18 ceppi batterici con un'elevata somiglianza con OTU batterici altamente abbondanti dal legno morto studiato.

Test di coltivazione

L'attività della frazione di enzimi associata alla parete cellulare è stata misurata nelle cellule dopo 2 settimane di incubazione in triplicato in 50 mL di terreno liquido GY-VL55 come descritto in precedenza (Lasa et al., 2019). Per valutare la capacità di crescere sulla cellulosa, è stato preparato un terreno di carbossimetilcellulosa (CMC) (5 g L ⁻¹ CMC, 2 g L ⁻¹ estratto di lievito, 15 g L ⁻¹ agar, pH 5). Le piastre sono state incubate a 24°C per 2 settimane. Dopo l'incubazione, 12 mL di Rosso Congo all'1% sono stati versati su ciascuna piastra, la colorazione è stata eseguita per 30 minuti, il Rosso Congo è stato sostituito con 12 mL di NaCl 1 M, il NaCl è stato lasciato per 30 minuti, il NaCl è stato sostituito con 12 mL di H ₂ O e l'H ₂ O è stato lasciato per una notte. La presenza di un alone intorno alle colonie indicava l'utilizzo della CMC.

Estrazione, sequenziamento, assemblaggio del genoma e annotazione del DNA

I ceppi batterici selezionati sono stati coltivati in 50 mL di terreno liquido GY-VL55 agitato in fiasche di Erlenmeyer (Lladó et al., 2019) per 2 settimane a 23°C. Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione e il DNA è stato estratto da un kit ArchivePure DNA Yeast and Gram-+ (5 Prime, Germania) secondo le istruzioni del produttore. Il DNA è stato tranciato da un dispositivo di sonicazione Bioruptor Pico (Diagenode, Belgio) a una lunghezza media di 550 bp e gli adattatori di sequenziamento sono stati legati dal kit di preparazione della libreria TruSeq DNA PCR-Free (Illumina Inc., USA). Le librerie legate sono state sequenziate internamente sulla piattaforma Illumina MiSeq.

L'assemblaggio del genoma di ciascun isolato è stato eseguito utilizzando un Unicycler 0.4.7 (Wick et al., 2017) in modalità normale con i seguenti programmi: SPAdes 3.13.0 (Bankevich et al., 2012), BLAST 2.7.1+ (Altschul et al., 1997), Bowtie 2.2.4 (Langmead et al., 2009), SAMtools 1.9 (Li et al., 2009) e Pilon 1.22 (Walker et al., 2014). Prokka 1.13.3 (Seemann, 2014) con RNAmmer (Lagesen et al., 2007) è stato utilizzato per la chiamata genica, l'annotazione e l'identificazione genica dell'rRNA. La tassonomia del genoma completo più vicino nel database NCBI con una somiglianza del >97% delle sequenze geniche dell'rRNA 16S è stata utilizzata per assegnare i ceppi a livello di genere. GToTree v1.5.39 (Lee, 2019) insieme a Prodigal (Hyatt et al., 2010), HMMER3 (Eddy, 2011), Muscle (Edgar, 2004), trimAI (Capella-Gutiérrez et al., 2009), FastTree2 (Price et al., 2010) e GNU Parallel (Tange, 2018) è stato utilizzato per costruire un albero filogenetico dei genomi basato su un set di profili HMM per 74 geni batterici a copia singola.

Per l'annotazione di CAZyme, è stata utilizzata la predizione del gene Prokka per ottenere le sequenze dei geni. Le sequenze di amminoacidi sono state confrontate con la versione del database dbCAN 07312018 utilizzando lo script run-dbcan.py (Zhang et al., 2018) e HMMER 3.2.1 (Eddy, 2011). I CAZymes con un valore e ≤ 1E ⁻³⁰ sono stati presi in considerazione per ulteriori annotazioni e i loro substrati bersaglio più probabili sono stati identificati sulla base dei geni con funzioni caratterizzate nel database CAZy (http://www.cazy.org; Lombard et al., 2014). Le funzioni dei geni predetti sono state annotate con la funzione hmmsearch in HMMER 3.2.1, utilizzando il database FOAM come fonte di HMM per geni rilevanti (Prestat et al., 2014). Le funzioni FOAM con un valore e ≤ 1E ⁻³⁰ sono state prese in considerazione per ulteriori annotazioni. Nel caso di geni con più di un hit nei database dbCAN e FOAM, è stata selezionata la funzione con il valore e più basso.

Mappatura del metagenoma

I metagenomi del legno morto di F. sylvatica in decomposizione naturale sono stati ottenuti in uno studio precedente (Tláskal et al., 2021a, Tláskal et al., in fase di revisione) e utilizzati per quantificare la copertura del genoma nel legno morto di varie lunghezze di decadimento. Questo studio sul metagenoma ha incluso 25 campioni di CWD di F. sylvatica . I campioni di CWD sono stati classificati in cinque classi di lunghezza del decadimento di <4, 4-7, 8-19, 20-41 e > 41 anni. Le letture metagenomiche sono state mappate sui genomi come descritto in precedenza (Lladó et al., 2019) utilizzando Bowtie v2.3.4.1 (Langmead e Salzberg, 2013). Le letture metagenomiche dal campione con SRR10968255 di adesione NCBI sono state omesse dalla mappatura a causa del sottocampionamento. Il numero di letture mappate è stato normalizzato alla profondità di sequenziamento di ciascun campione, diviso per la lunghezza del genoma dei singoli ceppi e moltiplicato per la dimensione media del genoma dei ceppi sequenziati batteri. Le differenze tra i gruppi sono state testate mediante il test di Kruskal-Wallis utilizzando il pacchetto agricolae (de Mendiburu, 2017) e considerate statisticamente significative al livello P < 0,05.

Filogenesi basata sul gene 16S rRNA di OTU e ceppi

dereplicati I geni 16S rRNA di ceppi con genomi sequenziati sono stati fusi con sequenze OTU rappresentative (sequenze più frequenti da ciascun OTU, Tláskal et al., 2017). Sono stati selezionati solo gli OTU più abbondanti a livello globale, rappresentati da un'abbondanza >0,5% in >10 campioni ( n = 86 OTU). Le sequenze sono state allineate dallo strumento online MAFFT (Katoh et al., 2018) con le impostazioni predefinite. Un albero filogenetico è stato costruito utilizzando FastTree2 (Price et al., 2010) con impostazioni predefinite. La tassonomia delle punte degli alberi è stata assegnata con DECIPHER v2.0 (Wright, 2016) utilizzando il database SILVA SSU release 138 (Quast et al., 2013). Un albero filogenetico del 16S Le sequenze di rRNA di tutti i 959 isolati ottenuti sono state costruite con lo stesso approccio. La diversità dell'intera collezione isolata è stata dedotta mediante clustering utilizzando VSEARCH 2.4.3 (Rognes et al., 2016). Le tabelle sono state elaborate utilizzando R 4.0.2 (R Core Team, 2020) e tidyverse 1.3.0 (Wickham et al., 2019). Le immagini risultanti sono state elaborate con Inkscape 1.0 (https://inkscape.org/).

L'isolamento

ha prodotto 959 isolati, con i Gammaproteobatteri che sono la classe più rappresentata, seguita dalla classe Alphaproteobacteria e dai phyla Actinobacteria, Bacteroidetes, Acidobacteria e Firmicutes (Figura supplementare 1A). La quota maggiore di isolati è stata rappresentata dal complesso Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia (17%), seguito dai generi Mucilaginibacter (7%) e Pseudomonas (7%, Figura 1B supplementare). Isolati raggruppati in 467 OTU (>99% di somiglianza) e sono stati raggruppati nel 4,5% degli OTU dallo studio sull'amplicone dell'rRNA 16S dagli stessi campioni di CWD pubblicati in precedenza (Tláskal et al., 2017). Gli isolati rappresentavano in media il 33,5 ± l'1,3% dei batteri in un campione di CWD. La classe di età più giovane del legno morto, comprendente campioni di CWD con una lunghezza di decomposizione <5 anni, era la più rappresentata dagli isolati (38,8 ± 2,6%).

I ceppi sequenziati selezionati raggruppavano lo 0,7% degli OTU batterici, che rappresentavano il 15,3± lo 0,8% dei batteri nei campioni di CWD (Figura 2 supplementare; Tabella 1). La filogenesi di 86 OTU dominanti nell'intero set di dati di ampliconi, cioè quelli che rappresentano sequenze del >0,5% in campioni di CWD >10, ha mostrato che abbiamo recuperato membri dei primi cinque phyla batterici del legno morto e classi di Proteobatteri . Questi erano Acidobacteria, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Actinobacteria e Bacteroidetes (Figura 1; Tabella 1). I membri di altri phyla che rappresentavano solo una piccola minoranza tra gli OTU dominanti – Firmicutes ( n = 1), classe Polyangia ( n = 1), Planctomycetes ( n = 2), Verrucomicrobia ( n = 5) e WPS-2 ( n = 1) – non erano isolati o non sono riusciti a crescere nelle culture successive. Ad eccezione dei ceppi di Bradyrhizobium (1,5%), ogni genoma rappresentava in media il <1% dei batteri in tutti i campioni di CWD. Fino al 26,7% dei batteri era rappresentato nei campioni di CWD meglio coperti (Tabella 1).

L'analisi CAZy ha mostrato un notevole livello di variazione nei caratteri di utilizzo del carbonio tra i ceppi (Figura 2). Quattro ceppi si distinguevano in termini di alto numero di CAZyme e diversità: due acidobatteri (Edaphobacter ceppo 441 e Granulicella ceppo 53), Mucilaginibacter ceppo 454 e Sphingomonas ceppo 22. Il ceppo Granulicella ha mostrato il maggior numero di CAZymes ( n = 187 in 72 famiglie CAZy), che rappresentano il 3,7% dei suoi geni totali. Al contrario, sei membri del genere Variovorax, Pseudomonas e Bradyrhizobium contenevano solo 62-75 CAZymes in 28-35 famiglie CAZy, che rappresentavano l'1% dei loro geni totali (Figura 2).

L'analisi funzionale dei CAZymes identificati ha mostrato le specifiche fonti di C bersaglio dei ceppi (Figura 2). I geni per la degradazione della cellulosa erano presenti in tre copie della cellulasi GH6 nel genoma di Glaciihabitans ceppo 435. Il ceppo Mucilaginibacter 454 e il ceppo 22 di Sphingomonas contenevano ciascuno due copie di cellulasi. Altri ceppi con una singola copia di un gene cellulasi includevano entrambi i ceppi di Acidobacteria, entrambi i ceppi di Caballeronia, entrambi i ceppi di Sodalis e il ceppo 380 di Mesorhizobium. Un aumento del numero di geni della chitinasi era presente nel ceppo 53 di Granulicella e nel ceppo 441 di Edaphobacter ( n = 7 e 5, rispettivamente). Il ceppo 454 di Mucilaginibacter conteneva tre geni per gli enzimi coinvolti nella degradazione della chitina e il ceppo 328 di Luteibacter conteneva due chitinasi. Entrambi i ceppi di Pseudomonas codificavano un singolo gene della chitinasi e geni che codificavano enzimi che miravano alla chitina erano presenti in entrambi i ceppi di Variovorax, Caballeronia ceppo 276 e Sphingomonas ceppo 22. Un aumento del numero di emicellulasi erano presenti in due ceppi di Acidobacteria, il ceppo 22 di Sphingomonas, il ceppo 454 di Mucilaginibacter e il ceppo 328 di Luteibacter. I CAZimi per i substrati labili cellobiosio e xilobiosio e le α-glucanasi erano presenti in tutti i ceppi isolati senza differenze evidenti. I CAZimi per altri substrati labili, pectinasi, β-glucanasi ed enzimi che degradano i glicoconiugati, sono stati trovati preferenzialmente nei ceppi di Acidobacteria ad alto contenuto di CAZy, nel ceppo 454 di Mucilaginibacter, nel ceppo 435 di Glaciihabitans e nel ceppo 22 di Sphingomonas. Due ceppi di Pseudomonas contenevano geni litici polisaccaridici monoossigenasi della famiglia CAZy AA10 per l'ossidazione di un'ampia gamma di polisaccaridi. Alcuni dei genomi a basso contenuto di CAZy contenevano geni per l'assorbimento del C da fonti alternative: il gene mxaF per la metanolo deidrogenasi, che ossida il metanolo, era presenti in Variovorax e Caballeronia (entrambi Burkholderiales ), e quattro copie di questo gene erano presenti nel ceppo Bradyrhizobium 411. Il mesorhizobium insieme a Caballeronia conteneva geni per le monoossigenasi solubili del diferro.

Il ceppo 328 di Luteibacter ha mostrato di gran lunga la frazione enzimatica associata alla parete cellulare più attiva. Ad eccezione del Luteibacter , l'attività della chitinasi era più alta nei ceppi di Bradyrhizobium, Variovorax e Pseudomonas. I ceppi di Pseudomonas, Variovorax e Luteibacter non sono stati in grado di crescere su terreno CMC, ma hanno mostrato attività di cellobioidrolasi e β-glucosidasi adatte alla degradazione di oligosaccaridi derivati dalla cellulosa (Tabella 1; Figura supplementare 3).

I geni correlati al ciclo dell'azoto hanno mostrato una maggiore presenza nei genomi degli alfaproteobatteri e Gammaproteobatteri (Figura 2). Il ceppo Bradyrhizobium 78, il ceppo Mesorhizobium 380 e i due ceppi di Sodalis contenevano l'operone nitrogenasi nifHDK , che consente la fissazione dell'azoto. I genomi di entrambi i ceppi di Sodalis e del ceppo 380 di Mesorhizobium hanno mostrato una combinazione di geni nitrogenasi e geni cellulasi. I due ceppi Caballeronia e Sodalis contenevano un numero maggiore di geni per la riduzione dissimilatoria da nitrato a nitrito. I geni assimilatori per la riduzione dei nitrati sembrano essere limitati solo alla presenza del gene nasB in un numero ristretto di taxa. Al contrario, i geni assimilatori di riduzione dei nitriti nirAB erano presenti in quasi tutti i ceppi isolati. Le fasi di denitrificazione che portano alla produzione di N ₂ – riduzione dell'ossido nitrico e del protossido di azoto – non sono state rilevate in nessun genoma. Tuttavia diversi genomi (specialmente quelli del genere Sodalis ) contenevano geni per la riduzione dissimilatoria dei nitriti ( nrfC o nrfD ), dirigendo il flusso di N nella riduzione dissimilatoria dei nitrati verso la via dell'ammoniaca (DNRA). Analogamente ai geni di denitrificazione, i geni di nitrificazione, compresi quelli che consentono l'ossidazione dell'ammoniaca, mancavano nei genomi batterici esaminati.

I ceppi batterici sequenziati dal genoma differivano nella loro tendenza ad associarsi con legno morto di una certa lunghezza di decadimento, come dimostrato dalla mappatura delle letture del metagenoma dalla decomposizione di F. sylvatica . La mappatura ha mostrato che diversi ceppi erano limitati a legno morto molto fresco (<4 anni di decomposizione), mentre altri tendevano ad aumentare in abbondanza nelle fasi successive di decomposizione (Figura 3). Gli isolati Glaciihabitans ceppo 435, Pseudomonas ceppo 358, Sodalis ceppo 23 e 96 e Sphingomonas Il ceppo 22 era significativamente più abbondante nella CWD fresca, mentre diversi altri ceppi mostravano anch'essi un'elevata abbondanza nel legno morto fresco (ceppo Edaphobacter 441, Ceppo 276 di Caballeronia e Ceppo Mucilaginibacter 454) ma abitavano solo alcuni campioni di CWD della classe di età più giovane. L'abbondanza di altri ceppi, tra cui due ceppi di Bradyrhizobium e il ceppo 265 di Rhizobiales, ha raggiunto il picco più tardi durante la decomposizione. In particolare, i suddetti Alphaproteobacteria rappresentano i batteri con la più alta abbondanza nei metagenomi esaminati (Figura 3).

Discussione

Utilizzando la coltivazione prolungata, è possibile catturare un'ampia varietà di batteri, inclusi taxa a crescita lenta, con funzioni ecologiche potenzialmente importanti (Sait et al., 2002; Lladó et al., 2016). Il nostro isolamento, che ha portato a 959 isolati batterici di legno morto, era in parte ridondante, con molti taxa catturati ripetutamente (Figura 1 supplementare), ma a causa della presenza di diversi membri di OTU dominanti di legno morto, la raccolta rappresentava una porzione relativamente ampia della comunità batterica - in media, circa un terzo dei batteri presenti in CWD. A differenza della risoluzione del genoma indipendente dalla coltura, l'isolamento fornisce dati completi sul contenuto del genoma di un particolare ceppo senza la minaccia di genomi chimerici (Shaiber e Eren, 2019) e rappresenta un approccio adatto per descrivere completamente il ruolo dei membri chiave del microbioma (Valášková et al., 2009).

Abbiamo caratterizzato i membri dei taxa batterici del legno morto più abbondanti Acidobacteria, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Actinobacteria e Bacteroidetes . Questi phyla dominanti sembrano essere generalmente presenti nel legno morto (Johnston et al., 2016). Sebbene la nostra assegnazione funzionale dei geni sia stata effettuata nel modo più accurato possibile, va notato che, in alcuni casi, una famiglia di enzimi CAZy può mirare a diversi substrati (ad esempio, GH6; tali geni trovati nei Glaciihabitans hanno mostrato la più alta somiglianza con le endo-β-1,4-glucanasi note). Pertanto, mostriamo le funzioni più probabili dei CAZymes. Tra i batteri coltivati, abbiamo identificato ceppi con un aumentato potenziale per l'utilizzo di carboidrati complessi, tra cui cellulosa, chitina, emicellulosa e pectina. Questi ceppi appartengono ai phyla Acidobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria e al genere Sphingomonas dagli Alphaproteobacteria . Le forti capacità idrolitiche di questi taxa sono state riportate in precedenza per alcuni dei gruppi che abitano il suolo (Uroz et al., 2013; Větrovský et al., 2014; López-Mondéjar et al., 2019). In particolare, Acidobacteria e Bacteroidetes sono stati identificati come efficienti decompositori di biopolimeri di carboidrati (Lladó et al., 2019). Ciò corrisponde anche all'attività della chitinasi identificata (Lladó et al., 2016) e alla degradazione del micelio fungino da parte degli acidobatteri compreso il genere Granulicella (López-Mondéjar et al., 2018). Questo tratto è stato supportato da un aumento del numero di geni della chitinasi negli acidobatteri coltivati nel nostro studio.

A differenza dei degradatori generali, i gammaproteobatteri del legno morto e la maggior parte degli alfaproteobatteri ospitavano un numero inferiore di CAZymes, indicando uno spettro ristretto di potenziali fonti di C. I ceppi meno dotati di CAZy erano quelli assegnati ai generi Variovorax, Pseudomonas e Bradyrhizobium . Nonostante la mancanza di CAZymes per la degradazione dei composti di origine vegetale, come la cellulosa o l'emicellulosa, questi ceppi a basso contenuto di CAZy hanno il potenziale per compensare questo intervallo ristretto attraverso la decomposizione della biomassa fungina. L'aderenza alle ife fungine o l'arricchimento in presenza di funghi sono stati ripetutamente descritti per Burkholderiales , suggerendo uno stile di vita micofago per questi ceppi (Valášková et al., 2009; Hervé et al., 2016; Brabcová et al., 2018; Starke et al., 2020). I nostri ceppi Variovorax e Caballeronia di Burkholderiales contenevano infatti geni della chitosanasi e della N-acetilglucosaminidasi, rispettivamente, che sono coinvolti nella degradazione dei principali biopolimeri strutturali fungini chitina e chitosano. Il genere Pseudomonas ha mostrato una presenza del gene della chitinasi simile a ceppi dello stesso genere coinvolti nella decomposizione della biomassa fungina (Starke et al., 2020). L'attività chitinolitica degli enzimi legati alla membrana è stata misurata per i ceppi di Bradyrhizobium e Luteibacter. Il Luteibacter ha mostrato la più alta attività chitinasica in questo studio e la sua attività micolitica e cellulolitica è stata descritta in precedenza (López-Mondéjar et al., 2016; Mieszkin et al., 2021); Il Luteibacter ha inoltre mostrato un'attività generalmente elevata degli enzimi legati alla membrana (Lasa et al., 2019).

I batteri delle classi Alphaproteobacteria e Gammaproteobacteria , che sono a basso contenuto di enzimi attivi nei carboidrati, hanno mostrato la presenza di geni per l'ossidazione putativa del metanolo. I geni per le monoossigenasi solubili di diferro in Caballeronia e Mesorhizobium indicano l'ossidazione di altre fonti di C a bassa massa molecolare piuttosto che l'esecuzione della metanotrofia che non è stata descritta per questi taxa (Leahy et al., 2003). Complessivamente, la presenza di questi geni suggerisce che Alphaproteobacteria e Gammaproteobacteria utilizzino semplici composti C generati durante la decomposizione della lignina da parte di funghi (Filley et al., 2002; Lenhart et al., 2012). La metilotrofia degli alfaproteobatteri è talvolta accompagnata da attività diazotrofica (Vorob'ev et al., 2009). Modifiche in la composizione della comunità batterica del legno morto è strettamente legata ai cambiamenti nel pH, nel contenuto d'acqua e nel rapporto C:N del substrato (Hoppe et al., 2015; Tláskal et al., 2017). Il rapporto C/N del legno morto fresco è molto elevato e diminuisce durante la decomposizione, che è il risultato dell'accumulo di N in parte attraverso la traslocazione fungina e principalmente attraverso la fissazione batterica di N ₂ (Rayner e Boddy, 1988; Rinne et al., 2016; Tláskal et al., 2021a).

La capacità di fissare l'N ₂ potrebbe spiegare l'associazione degli Alfaproteobatteri con le condizioni a basso N e la loro correlazione positiva con il rapporto C:N (Rinta-Kanto et al., 2016; Mieszkin et al., 2021). Studi precedenti hanno rilevato l'ordine Rhizobiales ( Alphaproteobacteria ) come uno dei membri abbondanti nella comunità del legno morto (Hervé et al., 2013) e hanno mostrato la presenza di geni nitrogenasi assegnati a questo gruppo (Hoppe et al., 2015). In linea con ciò, abbiamo coltivato due ceppi di Rhizobiales contenenti l'operone nitrogenasi nifHDK. Gli altri due fissatori di azoto sono enterobatteri del genere Sodalis , ed entrambi sono strettamente imparentati con gli endosimbionti degli insetti di Sodalis che mancano dei geni della nitrogenasi (Tláskal et al., 2021b). Dopo quasi 40 anni, i ceppi non simbiotici di Sodalis e Rhizobiales che fissano l'N ₂ ampliano un piccolo gruppo di batteri diazotrofici coltivati a legno morto recuperati con successo dalla CWD in decomposizione naturale (Seidler et al., 1972; Spano et al., 1982). I ceppi di Sodalis erano più abbondanti nella decomposizione precoce, quando la limitazione dell'azoto era più grave, e l'abbondanza di Rhizobiales ha raggiunto il picco più tardi. Il legno morto sembra essere un hotspot di fissazione non simbiotica di N ₂, e questi abbondanti taxa contribuiscono all'arricchimento di N del substrato (Brunner e Kimmins, 2003; Tláskal et al., 2021a). In particolare, tre dei quattro ceppi che fissano l'azoto (i due ceppi Sodalis e Mesorhizobium) contenevano anche un singolo gene cellulasi, il che suggerisce che questi ceppi potrebbero essere indipendenti nell'utilizzo di substrati recalcitranti. L'esame di altre vie del ciclo dell'N mostra che i geni che codificano per le fasi dissimilatorie sono meno comuni di quelli che codificano per le fasi assimilatorie. In particolare, i ceppi di Sodalis (e in parte i ceppi di Caballeronia) contengono geni per DNRA, consentendo la trasformazione di forme ossidate di N in ammonio. L'equilibrio tra DNRA e denitrificazione è cruciale per il bilancio dell'azoto del suolo (Nelson et al., 2016), e un meccanismo simile potrebbe esistere nel legno morto. L'assenza di denitrificazione completa e la via DNRA preferita prevengono quindi la perdita di scarso azoto (Tláskal et al., 2021a).

La composizione della comunità batterica ha dimostrato di subiscono un cambiamento significativo tra le fasi di decomposizione precoce e tardiva a un'età del legno morto di ~15 anni (Tláskal et al., 2017). Qui, diversi ceppi hanno mostrato una preferenza per il legno morto molto giovane e quasi intatto (anche se c'era un'alta variazione tra i singoli fusti freschi), mentre gli stessi ceppi erano meno abbondanti nelle successive fasi di decomposizione. Al contrario, i ceppi che hanno raggiunto la massima abbondanza nella fase di decomposizione tardiva erano considerevolmente meno abbondanti nel legno morto fresco. I batteri coinvolti nella fissazione dell'N ₂ si trovano nel legno morto fresco e nelle successive fasi di decomposizione, dimostrando l'importanza di questa attività durante la decomposizione. Poiché i biopolimeri vegetali più facilmente disponibili si esauriscono gradualmente durante la decomposizione, i batteri con geni per la degradazione della chitina potrebbero passare all'utilizzo di C dalla biomassa fungina. Batteri micofagi come Granulicella, Luteibacter , e Burkholderiales tendeva infatti ad essere più abbondante nelle fasi successive di decomposizione, quando la biomassa fungina nel legno morto aumenta e inizia a rappresentare una fonte relativamente facilmente accessibile sia di C che di N.

Diverse strategie di utilizzo del C sono state descritte per gli habitat del suolo in cui Acidobacteria e Bacteroidetes fungevano da decompositori con un alto numero di CAZimi espressi, mentre i Proteobacteria sono stati riconosciuti come opportunisti facendo affidamento sull'assorbimento di C da altre fonti labili (Lladó et al., 2019). Con l'elevata sovrapposizione tassonomica e funzionale in questi gruppi di suoli, possiamo identificare due strategie distinte di abbondanti taxa batterici del legno morto: degradatori con alto potenziale di decomposizione e batteri meno generalisti che soddisfano il loro fabbisogno di C con l'utilizzo di fonti alternative e la micofagia. Inoltre, questi ultimi sono attivi nel ciclo dell'azoto, e la loro presenza potrebbe essere vantaggiosa per il totale comunità microbica dovuta alla fissazione di N ₂. I batteri metabolicamente diversi mostrano quindi adattamenti specifici agli habitat difficili del legno morto e completano la decomposizione del legno morto guidata dai funghi attraverso l'arricchimento di azoto.

Disponibilità del codice

I metodi sopra indicati indicano i programmi utilizzati per l'analisi all'interno delle relative sezioni. Il codice per riprodurre l'elaborazione della sequenza è fornito all https://github.com/TlaskalV/Deadwood-bacterial-isolates

Dichiarazione di disponibilità dei dati

I dati descritti in questo manoscritto, comprese le sequenze grezze provenienti dal sequenziamento a lettura breve e i file di assemblaggio del genoma, sono stati depositati in NCBI con i numeri di accesso a BioProject riassunti nella Tabella 1.

VT e PB hanno ideato lo studio e scritto il manoscritto. VT ha eseguito l'isolamento del ceppo, l'elaborazione del genoma e la caratterizzazione della crescita del ceppo. Tutti gli autori hanno contribuito all'articolo e ha approvato la versione presentata.

Finanziamento

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Czech Science Foundation (21-09334J).

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Il materiale supplementare per questo articolo può essere trovato online all'indirizzo: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2021.685303/full#supplementary-material

Riferimenti

Parole chiave: legno morto, genomi batterici, cellulosa, micofagia, fissazione dell'azoto

Citazione: Tláskal V e Baldrian P (2021) I batteri che abitano il legno morto mostrano adattamenti al cambiamento della disponibilità di carbonio e azoto durante la decomposizione. fronte. Microbiolo. 12:685303. doi: 10.3389/fmicb.2021.685303

Ricevuto: 24 marzo 2021; Accettato: 04 maggio 2021;
Pubblicato: 17 giugno 2021.

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*Corrispondenza: Vojtěch Tláskal, dGxhc2thbCYjeDAwMDQwO2Jpb21lZC5jYXMuY3o=