Come funziona un rilevatore uv
Rilevamento dell'assorbanza: rivelatori a raggi ultravioletti e rivelatori a matrice di
Il rilevamento dell'assorbanza è il metodo di rilevamento più comune nell'analisi HPLC.
La luce è un tipo di onda elettromagnetica e alle onde elettromagnetiche vengono dati nomi diversi a seconda delle loro lunghezze d'onda. La Fig.1 mostra i tipi di onde elettromagnetiche e le loro corrispondenti lunghezze d'onda.
Fig.1 Lo spetrum
elettromagnetico
Quando una sostanza viene irradiata con luce, assorbe luce di una specifica lunghezza d'onda e l'energia degli elettroni passa dal loro stato fondamentale (stato più basso) a uno stato eccitato (stato ad alta energia). La lunghezza d'onda della luce assorbita dipende dalla struttura della sostanza. La luce nell'intervallo dall'ultravioletto al visibile viene utilizzata per il rilevamento dell'assorbanza.
Fig.2 mostra il principio del rilevamento dell'assorbanza nell'analisi HPLC. L'assorbanza viene misurata monitorando la velocità di diminuzione della quantità di luce che passa attraverso la cella quando irradia la soluzione nella cella a flusso con luce di una particolare lunghezza d'onda. L'assorbanza è proporzionale alla concentrazione della sostanza target. Questa può essere definita come la legge di Lambert-Beer.
Fig.2 Principio di rilevamento dell'assorbanza nell'analisi HPLC (sopra: Misura dell'assorbanza, sotto: Legge di Lambert-Beer)
La concentrazione del componente può essere calcolata misurando la variazione di assorbanza della fase mobile che passa attraverso la cella di flusso del rivelatore. Secondo la legge di Lambert-Beer, l'assorbanza è proporzionale alla concentrazione del componente, ma in pratica, una concentrazione troppo alta impedisce al rivelatore di ottenere una misura accurata, come mostrato in Fig.2 . Pertanto, è necessario quantificare all'interno di un intervallo di concentrazione che garantisca una proporzione lineare con il tasso di assorbanza, altrimenti noto come intervallo dinamico.
La Fig. 3 mostra un diagramma schematico di un rivelatore ultravioletto (UV). Una lampada al deuterio (D2) viene utilizzata come sorgente di luce ultravioletta per il rivelatore UV. La luce emessa dalla lampada viene separata in un fascio di luce di una certa lunghezza d'onda con un reticolo di diffrazione, quindi passa attraverso la cella di flusso. La luce che passa attraverso la cella di flusso entra nel fotorivelatore (fotodiodo) e viene convertita in un segnale elettrico corrispondente all'intensità della luce, che viene elaborato come assorbanza. Un rivelatore UV-visibile con una lampada D2 e una lampada al tungsteno è adatto per il monitoraggio non solo della luce ultravioletta ma anche della luce visibile.
La Fig. 4 mostra un diagramma schematico di un rivelatore a matrice di fotodiodi (PDA *). Luce emessa da una lampada installata nel PDA il rivelatore passa attraverso la cella di flusso e poi separato con un reticolo di diffrazione. Quando il raggio di luce separato viene ricevuto da un fotodiodo, che è una sequenza di 1.024 fotorivelatori, solo le lunghezze d'onda nell'intervallo specificato vengono convertite in segnali elettrici ed elaborate come dati di assorbanza. *In alcuni casi, questo è chiamato rivelatore a matrice di diodi (DAD).
Fig.3 Diagramma schematico di un rivelatore
Fig.4 Diagramma schematico di un rivelatore
PDA
Fig.5 Dati ottenuti con un rivelatore PDA
L'utilizzo di un rivelatore PDA consente di misurare uno spettro UV continuo, ottenendo un cromatogramma a più lunghezze d'onda. Il rivelatore fornisce non solo un cromatogramma che si riferisce al tempo sull'asse X e all'assorbanza sull'asse Y, come ottenuto con il rivelatore UV, ma anche dati tridimensionali aventi un asse di lunghezza d'onda sull'asse Z. (Fig.5)
La Fig. 6 mostra un esempio di analisi degli assorbenti ultravioletti, che sono principi attivi nei cosmetici, utilizzando un rivelatore PDA. Come mostrato nella figura a sinistra della Fig. 6, l'analisi con un rivelatore PDA può ottenere cromatogrammi a più lunghezze d'onda contemporaneamente. La figura a destra mostra uno spettro UV nella parte superiore di ciascun picco composto.
La differenza nella lunghezza d'onda massima di assorbimento dello spettro UV di ciascun componente consente l'analisi simultanea a diverse lunghezze d'onda. L'identificazione con un rivelatore UV confronta solo i tempi di ritenzione del composto target in campioni standard e sconosciuti, mentre i rivelatori PDA confrontano gli spettri UV oltre al tempo di ritenzione.
Fig.6 Analisi degli assorbenti UV nei cosmetici con il rivelatore
PDA
Fig.7 Identificazione basata sullo spettro UV
La Fig. 7 mostra una sovrapposizione sia degli spettri UV del campione che degli spettri UV standard per il picco B quando rilevato a 310 nm. Si suggerisce che gli spettri UV dei composti rilevati nei cosmetici siano gli stessi composti della sostanza standard perché i due spettri UV coincidono. L'uso di rivelatori PDA può ottenere uno spettro UV, consentendo un'analisi qualitativa più affidabile.
Analisi qualitativa degli assorbenti UV nei cosmetici basata sullo spettro
UV-Vis
Inoltre, alcuni prodotti consentono l'elaborazione software dei dati ottenuti utilizzando un rivelatore PDA per separare i picchi non separati ed espandere la gamma dinamica.