Come può una proteina denaturarsi

Perdita di struttura nelle proteine e negli acidi nucleici a causa di stress

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In biochimica, denaturazione è un processo in cui le proteine o gli acidi nucleici perdono la struttura ripiegata presente nel loro stato nativo a causa di vari fattori, tra cui l'applicazione di alcuni stress o composti esterni, come un acido o una base forte, un sale inorganico concentrato, un solvente organico (ad esempio, alcol o cloroformio), agitazione e radiazioni o calore. ^[3] Se le proteine in una cellula vivente vengono denaturate, ciò provoca l'interruzione dell'attività cellulare e possibilmente la morte cellulare. La denaturazione delle proteine è anche una conseguenza della morte cellulare. ^{[4] [5]} Le proteine denaturate possono esibire un'ampia gamma di caratteristiche, dal cambiamento conformazionale e la perdita di solubilità o dissociazione di cofattori all'aggregazione dovuta all'esposizione di gruppi idrofobici. La perdita di solubilità a seguito della denaturazione è chiamata coagulazione . ^[6] Le proteine denaturate perdono la loro struttura 3D e quindi, non può funzionare.

Il corretto ripiegamento delle proteine è la chiave per stabilire se una proteina globulare o di membrana può svolgere correttamente il suo lavoro; deve essere ripiegata nella forma nativa per funzionare. Tuttavia, i legami idrogeno e il legame cofattore-proteina, che svolgono un ruolo cruciale nel ripiegamento, sono piuttosto deboli e quindi facilmente influenzati dal calore, dall'acidità, dalle variazioni delle concentrazioni di sale, dagli agenti chelanti e da altri fattori di stress che possono denaturare la proteina. Questo è uno dei motivi per cui l'omeostasi cellulare è fisiologicamente necessaria nella maggior parte delle forme di vita.

Esempi

comuni

Quando il cibo viene cotto, alcune delle sue proteine si denaturano. Questo è il motivo per cui le uova sode diventano dure e la carne cotta diventa soda.

Un classico esempio di denaturazione delle proteine proviene dall'albume d'uovo, che in genere sono in gran parte albumine d'uovo in acqua. Freschi di uova, gli albumi sono trasparenti e liquidi. La cottura dei bianchi termicamente instabili li trasforma opaco, formando una massa solida interconnessa. ^[7] La stessa trasformazione può essere effettuata con una sostanza chimica denaturante. Versare gli albumi in un becher di acetone renderà anche gli albumi traslucidi e solidi. La pelle che si forma sul latte cagliato è un altro esempio comune di proteina denaturata. L'antipasto freddo noto come ceviche viene preparato "cuocendo" chimicamente pesce crudo e crostacei in una marinata acida agli agrumi, senza calore. ^[8]

Le

proteine denaturate possono presentare un'ampia gamma di caratteristiche, dalla perdita di solubilità all'aggregazione proteica.

Le

proteine o polipeptidi sono polimeri di amminoacidi. Una proteina è creata dai ribosomi che "leggono" l'RNA che è codificato dai codoni nel gene e assemblano la necessaria combinazione di aminoacidi dall'istruzione genetica, in un processo noto come traduzione. Il filamento proteico appena creato subisce quindi una modifica post-traduzionale, in cui vengono aggiunti ulteriori atomi o molecole, ad esempio rame, zinco o ferro. Una volta completato questo processo di modificazione post-traduzionale, la proteina inizia a ripiegarsi (a volte spontaneamente e a volte con assistenza enzimatica), raggomitolandosi su se stessa in modo che gli elementi idrofobici della proteina siano sepolti in profondità all'interno della struttura e gli elementi idrofili finiscano all'esterno. La forma finale di una proteina determina il modo in cui interagisce con il suo ambiente.

Il ripiegamento delle proteine consiste in un equilibrio tra una notevole quantità di deboli interazioni intramolecolari all'interno di una proteina (interazioni idrofobiche, elettrostatiche e di Van Der Waals) e interazioni proteina-solvente. ^[9] Di conseguenza, questo processo dipende fortemente dallo stato ambientale che il proteina risiede in. ^[9] Queste condizioni ambientali includono, e non sono limitate a, temperatura, salinità, pressione e i solventi che sono coinvolti. ^[9] Di conseguenza, qualsiasi esposizione a stress estremi (ad esempio calore o radiazioni, elevate concentrazioni di sali inorganici, acidi e basi forti) può interrompere l'interazione di una proteina e portare inevitabilmente alla denaturazione. ^[10]

Quando una proteina viene denaturata, le strutture secondarie e terziarie vengono alterate, ma i legami peptidici della struttura primaria tra gli amminoacidi vengono lasciati intatti. Poiché tutti i livelli strutturali della proteina determinano la sua funzione, la proteina non può più svolgere la sua funzione una volta che è stata denaturata. Ciò è in contrasto con le proteine intrinsecamente non strutturate, che sono dispiegate nel loro stato nativo, ma ancora funzionalmente attive e tendono a ripiegarsi dopo essersi legate al loro bersaglio biologico. ^[11]

Come avviene la denaturazione a livelli di struttura proteica

Vedi anche: Struttura proteica

Perdita di funzione

La maggior parte dei substrati biologici perde la propria funzione biologica quando viene denaturata. Ad esempio, gli enzimi perdono la loro attività, perché i substrati non possono più legarsi al sito attivo, ^[13] e perché i residui di amminoacidi coinvolti nella stabilizzazione degli stati di transizione dei substrati non sono più posizionati per poterlo fare. Il processo di denaturazione e la perdita di attività associata possono essere misurati utilizzando tecniche come l'interferometria a doppia polarizzazione, CD, QCM-D e MP-SPR.

Perdita di attività dovuta a metalli pesanti e metalloidi

Prendendo di mira le proteine, è noto che i metalli pesanti interrompono la funzione e l'attività svolta dalle proteine. ^[14] I metalli pesanti rientrano in categorie costituite da metalli e una quantità selezionata di metalloidi. ^[14] Questi metalli, quando interagiscono con proteine native ripiegate, tendono a svolgere un ruolo nell'ostruire la loro attività biologica. ^[14] Questa interferenza può essere eseguita in diversi modi. Questi metalli pesanti possono formare un complesso con i gruppi funzionali della catena laterale presenti in una proteina o formare legami con i tioli liberi. ^[14] I metalli pesanti svolgono anche un ruolo nell'ossidazione delle catene laterali degli aminoacidi presenti nelle proteine. ^[14] Insieme a questo, quando interagiscono con le metalloproteine, i metalli pesanti possono dislocare e sostituire gli ioni metallici chiave. ^[14] Di conseguenza, i metalli pesanti possono interferire con le proteine ripiegate, il che può scoraggiare fortemente la stabilità e l'attività delle proteine.

Reversibilità e irreversibilità

In molti casi, la denaturazione è reversibile (le proteine possono riacquistare il loro carattere nativo). quando l'influenza denaturante viene rimossa). Questo processo può essere chiamato rinaturazione . ^[15] Questa comprensione ha portato all'idea che tutte le informazioni necessarie alle proteine per assumere il loro stato nativo fossero codificate nella struttura primaria della proteina, e quindi nel DNA che codifica per la proteina, la cosiddetta "ipotesi termodinamica di Anfinsen". ^[16]

La denaturazione può anche essere irreversibile. Questa irreversibilità è tipicamente un'irreversibilità cinetica, non termodinamica, poiché una proteina ripiegata ha generalmente un'energia libera inferiore rispetto a quando è dispiegata. Attraverso l'irreversibilità cinetica, il fatto che la proteina sia bloccata in un minimo locale può impedirle di ripiegarsi dopo essere stata denaturata in modo irreversibile. ^[17]

La denaturazione delle proteine dovuta alla denaturazione del pH

può anche essere causata da variazioni del pH che possono influenzare il chimica degli amminoacidi e dei loro residui. I gruppi ionizzabili negli amminoacidi sono in grado di ionizzarsi quando si verificano cambiamenti nel pH. Un cambiamento del pH in condizioni più acide o più basiche può indurre lo spiegamento. ^[18] Lo sfolding indotto da acidi si verifica spesso tra pH 2 e 5, mentre lo unfolding indotto da basi di solito richiede un pH 10 o superiore. ^[18]

Gli

acidi nucleici (inclusi RNA e DNA) sono polimeri nucleotidici sintetizzati dagli enzimi polimerasi durante la trascrizione o la replicazione del DNA. Dopo la sintesi di 5'-3' della spina dorsale, le singole basi azotate sono in grado di interagire tra loro tramite legami idrogeno, consentendo così la formazione di strutture di ordine superiore. La denaturazione dell'acido nucleico si verifica quando il legame idrogeno tra i nucleotidi viene interrotto e provoca la separazione di trefoli precedentemente ricotta. Ad esempio, la denaturazione del DNA a causa delle alte temperature provoca la rottura delle coppie di basi e la separazione dell'elica a doppio filamento in due singoli filamenti. I filamenti di acido nucleico sono in grado di ricuocere quando vengono ripristinate le condizioni "normali", ma se il ripristino avviene troppo rapidamente, i filamenti di acido nucleico possono ricuocere in modo imperfetto con conseguente accoppiamento improprio delle basi.

Denaturazione

indotta biologicamente

Le interazioni non covalenti tra filamenti antiparalleli nel DNA possono essere interrotte al fine di "aprire" la doppia elica quando sono impostati meccanismi biologicamente importanti come la replicazione del DNA, la trascrizione, la riparazione del DNA o il legame proteico. ^[19] L'area del DNA parzialmente separato è nota come bolla di denaturazione, che può essere più specificamente definita come l'apertura di una doppia elica del DNA attraverso il coordinamento Separazione delle coppie di basi. ^[19]

Il primo modello che tentò di descrivere la termodinamica della bolla di denaturazione fu introdotto nel 1966 e chiamato Modello Poland-Scheraga. Questo modello descrive la denaturazione dei filamenti di DNA in funzione della temperatura. All'aumentare della temperatura, i legami idrogeno tra le coppie di basi sono sempre più disturbati e iniziano a formarsi "anelli denaturati". ^[20] Tuttavia, il modello di Poland-Scheraga è ora considerato elementare perché non riesce a spiegare le implicazioni confondenti della sequenza del DNA, della composizione chimica, della rigidità e della torsione. ^[21]

Recenti studi termodinamici hanno dedotto che la durata di una singola bolla di denaturazione varia da 1 microsecondo a 1 millisecondo. ^[22] Queste informazioni si basano su scale temporali stabilite per la replicazione e la trascrizione del DNA. ^[22] Attualmente, ^sono in corso studi di ricerca biofisica e biochimica per chiarire più pienamente i dettagli termodinamici della bolla di denaturazione. ^[22]

Denaturazione dovuta ad agenti

chimici

Poiché la reazione a catena della polimerasi (PCR) è tra i contesti più popolari in cui si desidera la denaturazione del DNA, il riscaldamento è il metodo di denaturazione più frequente. ^[23] Oltre alla denaturazione per calore, gli acidi nucleici possono subire il processo di denaturazione attraverso vari agenti chimici come la formammide, la guanidina, il salicilato di sodio, il dimetilsolfossido (DMSO), glicole propilenico e urea. ^[24] Questi agenti denaturanti chimici abbassano la temperatura di fusione (T _m ) competendo per i donatori e gli accettori di legami idrogeno con coppie di basi azotate preesistenti. Alcuni agenti sono persino in grado di indurre la denaturazione a temperatura ambiente. Ad esempio, è stato dimostrato che gli agenti alcalini (ad esempio NaOH) denaturano il DNA modificando il pH e rimuovendo i protoni che contribuiscono al legame idrogeno. ^[23] Questi denaturanti sono stati impiegati per realizzare il gel per elettroforesi a gradiente di denaturazione (DGGE), che promuove la denaturazione degli acidi nucleici al fine di eliminare l'influenza della forma dell'acido nucleico sulla loro mobilità elettroforetica. ^[25]

L'attività

ottica (assorbimento e diffusione della luce) e le proprietà idrodinamiche (diffusione traslazionale, coefficienti di sedimentazione e tempi di correlazione rotazionale) degli acidi nucleici denaturati con formammide sono simili a quelle degli acidi nucleici denaturati termicamente. ^{[24] [26] [27]} Pertanto, a seconda dell'effetto desiderato, la denaturazione chimica del DNA può Fornire una procedura più delicata per la denaturazione degli acidi nucleici rispetto alla denaturazione indotta dal calore. Gli studi che confrontano diversi metodi di denaturazione come il riscaldamento, il mulino di perle di diverse dimensioni, la sonicazione delle sonde e la denaturazione chimica mostrano che la denaturazione chimica può fornire una denaturazione più rapida rispetto agli altri metodi di denaturazione fisica descritti. ^[23] Soprattutto nei casi in cui si desidera una rapida rinaturazione, gli agenti chimici di denaturazione possono fornire un'alternativa ideale al riscaldamento. Ad esempio, i filamenti di DNA denaturati con agenti alcalini come il NaOH si rinaturalizzano non appena viene aggiunto il tampone fosfato. ^[23]

Denaturazione dovuta all'aria

Piccole molecole elettronegative come l'azoto e l'ossigeno, che sono i gas primari nell'aria, influiscono in modo significativo sulla capacità delle molecole circostanti di partecipare al legame idrogeno. ^[28] Queste molecole competere con gli accettori di legami idrogeno circostanti per i donatori di legami idrogeno, agendo quindi come "interruttori dei legami idrogeno" e indebolendo le interazioni tra le molecole circostanti nell'ambiente. ^[28] I filamenti di antiparellel nelle doppie eliche di DNA sono legati in modo non covalente dal legame idrogeno tra coppie di basi; ^[29] L'azoto e l'ossigeno mantengono quindi il potenziale di indebolire l'integrità del DNA quando esposti all'aria. ^[30] Di conseguenza, i filamenti di DNA esposti all'aria richiedono meno forza per separarsi ed esemplificano temperature di fusione più basse. ^[30]

Applicazioni

Molte tecniche di laboratorio si basano sulla capacità dei filamenti di acido nucleico di separarsi. Comprendendo le proprietà della denaturazione degli acidi nucleici, sono stati creati i seguenti metodi:

Denaturanti

Denaturanti proteici

Acidi

I denaturanti proteici acidi includono:

Basi Le

basi funzionano in modo simile agli acidi nella denaturazione. Essi includono:

Solventi La

maggior parte dei solventi organici sono denaturanti, tra cui: ^{[ citazione necessaria ]}

Reagenti di reticolazione

Gli agenti di reticolazione per le proteine includono: ^{[ citazione necessaria ]}

Agenti caotropici

Gli agenti caotropici includono: ^{[ citazione necessaria ]}

Riduttori di

legame disolfuro Gli agenti che rompono i legami disolfuro per riduzione includono :

Agenti chimicamente reattivi

Agenti come il perossido di idrogeno, il cloro elementare, l'acido ipocloroso (acqua di cloro), il bromo, l'acqua di bromo, lo iodio, gli acidi nitrici e ossidanti e l'ozono reagiscono con parti sensibili come Solfuro/Tiolo, gli anelli aromatici attivati (fenilalanina) danneggiano infatti la proteina e la rendono inutilizzabile.

Altri

denaturanti dell'acido nucleico

Chimico

I denaturanti dell'acido nucleico includono:

I denaturanti dell'acido nucleico basico includono:

Altri denaturanti dell'acido nucleico includono:

Fisico

Vedi anche

Riferimenti

Collegamenti esterni